Pengantar Praktikum Hematologi

Tes Widal bagi Seorang Teknologi Laboratorium Medis

Seorang TLM bertugas di Puskesmas Kramat Jati, Jakarta, yang merupakan salah satu daerah yang padat penduduk. Suatu kesempatan, petugas diminta untuk melakukan pengambilan dan pemeriksaan sampel pada pasien yang diduga sedang menderita tipes. 

Apa pemeriksaan yang tepat untuk dilakukan ? 

Apa sampel yang harus diambil? 

Bagaimana cara melakukan pemeriksaan tersebut?

Tipes / tipoid / typhoid

Tipes adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, atau C. Gejala tipes antara lain demam, fatigue, sakit kepala, mual, sakit pada bagian perut / nyeri, konstipasi hingga diare. WHO memperkirakan apada tahun 2019, jumlah penderita tipes mencapai 9 juta jiwa dmana 100.000 jiwa diantaranya dilaporkan meninggal dunia. Kondisi lingkungan yang buruk seperti padat penduduk, termasuk daerah endemik, dan sanitasi yang buruk menjadi faktor utama angka pederita typhoid terus meningkat setiap tahun. Wilayah endemik penyakit tipes terdapat pada negara-negara berkembang di Asia Tenggara, Afrika, dan Mediterania. 

Penularan S. typhi dan S. paratyphi terjadi ketika seseorang tidak sengaja mengonsumsi makanan atau minuman yang terkontaminasi tinja atau urine penderita. Hal ini bisa terjadi jika penderita tidak mencuci tangan setelah menggunakan toilet, lalu menyentuh barang atau makanan yang dipakai atau dimakan oleh orang lain. Penularan bakteri ini juga bisa terjadi jika seseorang minum air dari sumber air yang telah terkontaminasi tanpa merebusnya terlebih dahulu. Selain itu, mengonsumsi hidangan laut yang mentah atau kurang matang dari sumber air yang tercemar juga dapat menjadi penyebab penularan bakteri S. typhi dan S. paratyphi.

Paratifoid / paratyphoid fever 

Demam yang disebabkan oleh Salmonella Paratyphi yang menyerang usus dan menyebar melalui aliran darah. Gejala yang dirasakan antara lain demam berhari-hari dengan suhu yang terus meningkat hingga keluhan pada saluran pencernaan. Seseorang dapat tertular bakteri S. paratyphi ketika tidak sengaja mengonsumsi makanan atau minuman yang terkontaminasi tinja atau urine penderita paratifus. Hal ini bisa terjadi jika penderita tidak mencuci tangan setelah menggunakan toilet, lalu menyentuh barang atau makanan yang dipakai atau dimakan oleh orang lain. Selain pada penderita paratifus, bakteri S. paratyphi juga bisa terdapat pada tinja atau urine orang yang telah sembuh dari paratifus, tetapi menjadi carrier bakteri tersebut.

Penularan bakteri ini juga bisa terjadi jika seseorang minum air dari sumber air yang telah terkontaminasi tanpa merebusnya terlebih dahulu. Selain itu, mengonsumsi hidangan laut yang mentah atau kurang matang dari sumber air yang tercemar juga dapat menjadi penyebab penularan bakteri S. paratyphi.

Salmonella 

Domain : Bacteria 

Phylum : Pseudomonadota 

Class : Gammaproteobacteria

Ordo : Enterobacterales 

Family : Enterobacteriaceae 

Genus : Salmonella 

Jadi, Salmonella itu genus.

Salmonella merupakan bakteri secara mikroskopis berbentuk basil dan bersifat gram negatif. Spesies Salmonella terdiri dari Salmonella enterica dan Salmonella bongori. Subspesies dari Salmonella enterica terdiri dari 6 subspesies dan terdiri dari 2650 serotipe. Salmonella enterica sub spesies dibagi berdasarkan serovars pada antigen somatik (O) dan flagellar (H), total ada 2650 serovars yaitu variasi pada bagian somatik dan flagellar ini. Salmonella enterica ini yang bertanggung jawab atas typhoid. Patogen ini merupakan patogen intraseluler yang masuk melalui pembuluh darah ke organ dan mengeluarkan endotoksin yang mampu membentuk sepsis menyebabkan hypovolemic shock dan septic shock. 

Salmonella enterica antara lain S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. indica, dan S. enterica subsp. houtenae. Salmonella berdasarkan serovars dibagi menjadi beberapa subspesies terpisah seperti S. typhi dan S. paratyphi. Nomenklatur ini masih digunakan hingga saat ini. Subspesies. 

Salmonella typhi umumnya hanya dideteksi berdasarkan keberadaan antigen somatik (O) dan Flagellar (H). Adapun Salmonella paratyphi penyebab paratifus terbagi dalam tiga jenis, yaitu: Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B (Salmonella schottmuelleri) dan Salmonella paratyphi C (Salmonella hirschfeldii). 

Tes Widal 

Tes yang dikembangkan sejak 1896 dan hasil tes ini gunakan untuk tujuan diagnostik. Apakah tes Widal masih cukup relevan digunakan dengan kemajuan teknologi di dunia kesehatan saat ini ? Widal termasuk metode yang klasik dan telah lama digunakan untuk mendeteksi penyakit yang disebabkan oleh Salmonella thyphi dan paratyphi.  

Prinsip 

Widal ini berdasarkan pada prinsip agulutinasi yang ditandai dengan adanya gumpalan atau aglutinasi pada suspensi akibat ikatan antara antibodi dan antigen. Sampel berupa serum dan pada awal pengembangannya, Widal menggunakan bakteri salmonella utuh yang dimatikan sebagai antigen.  Keberadaan antibodi spesifik salmonella di dalam serum pada bagian H (flagel) dan O (somatik) adalah yang dicari dan diidentifikasi. Jadi yang dicari adalah antibodi dalam serum, bukan keberadaan Salmonella dalam serum. 

Salmonella yang digunakan dalam widal yang tersisa hanya antkigen O dan H dari salmonella typhi dan parathyphi A dan B. IgM terhadap O yang akan muncul pertama dan merupakan penanda infeksi akut, IgG terhadap H akan muncul lebih lama seiring waktu infeksi. 

Kelebihan Tes Widal

1. Sederhana, tidak membutuhkan alat khusus dan modern
2. Ketersediaan dan kemudahan dalam penggunaan 
3. Tes yang cepat, sangat baik terutama untuk tujuan screening. 

Kekurangan Tes Widal

1. Angka positif palsu yang tinggi terutama pada pasien yang telah mendapatkan vaksinasi hingga infeksi yang lain, kurang spesifik
2. Hasil tes widal perlu dikonfirmasi dengan metode atau informasi yang lain.
3. Widal dinilai tidak signifikan untuk diganosis
4. Widal dinilai tidak sensitif dan spesifik untuk S thypi
5. Baseline titer teruatam pada daerah endemik dapat berbeda. 
6. Ada cross reaction dengan malaria
7. Dipengaruhi oleh status vaksinasi
8. Harus disertai dengan tes konfirmasi yang lain seperti kultur untuk isolasi dan identifikasi salmonella
9. Hanya cukup akurat untuk mendeteksi demam tipoid

Tes Widal pada Era Modern 

Tes Widal perlahan digantikan oleh Rapid test modern karena lebih cepat dan lebih akurat. Sensitivitas dan spesifisitas yang rendah membutuhkan banyak penelitian untuk membuat widal menjadi lebih sensitif dan spesifik, sebagai contoh dengan menggunakan antigen spesifik atau variasi antigen yang digunakan dalam tes widal. Tes widal pada era modern masih relevan untuk digunakan, terutama pada area-area yang tidak mempunyai fasilitas kesehatan yang lengkap dan modern, negara-negara berkembang. Hasil htes memang tidak spesifik tetapi sangat bagus untuk digunakan pada screening yang untuk dapat menginformasikan pada penyakit pada suatu area telah berlangsung. 

Hasil tes widal idealnya hanya untuk memperkuat kecurigaan dan diagnosis bahwa demam yang terjadi disebabkan oleh Salmonella terutama pada kondisi akut dan fase convalescent period yang ditandai dengan peningkatan kosentrasi antibodi 2-4 kali lipat. Saat ini, tes widal kalah dengan tes yang berbasis isolasi dan identifikasi salmonella karena peningkatan sanitasi, fasilitas laboratorium pada negara-negara maju, tetapi tidak pada negara-negara berkembang. Masalah terbesar tes widal adalah cross-reactivity menyebabkan positif palsu yang tinggi berujung pada kesalahan dalam diagnosis. Bahkan hasil riset menunjukkan bahwa hasil tes widal tidak dapat berdiri sendiri untuk menegakkan diganosis demam thypoid. 

Teknik dalam Tes Widal 

2 teknik yang tersedia untuk tes widal yaitu menggunakan slide atau tabung. Slide lebih baik digunakan untuk tujuan screening karna lebih cepat. Jika pada hasil screening terdapat aglutinasi, maka perlu dilakukan pengukuran semikuantitatif konsentrasi antibodi dengan melakukan pengenceran pada serum dengan hasil akhir berupa titer antibodi. Hal ini juga dapat dilakukan pada slide. Proses pengamatan aglutinasi dapat dibantu dengan menambahkan pencahayaan agar lebih jelas. 

Score untuk widal: 0 sampai 4+

0 : tidak ada aglutinasi 

1 : 25% aglutinasi 

2+ : 50% aglutinasi 

3+ : 75% aglutinasi 

4+ : 100% aglutinasi 

Tes Widal menggunakan tabung dinilai lebih rumit karena membutuhkan dan menggunakan banyak alat dan bersifat makroskopis, yang diamati adalah pelet Tes Widal menggunakan tabung sering digunakan sebagai tes lanjutan dari screening menggunakan slide. Dengan teknik tabung ini, tes membutuhkan inkubasi slemaa 20-24 jam pada suhu 37 derajat celcius (waterbath). Uji tabung berguna untuk memperjelas reaksi aglutinasi yang tidak menentu atau samar-samar yang diperoleh dengan uji slide yang lebih cepat.

Antibodi non spesifik terhadap salmonella bereaksi dengan dengan antigen salmonella mengarah pada reaksi silang menyebabkan hasil positif palsu. Penting untuk mengembangkan dan menjaga kualitas dari reagen bahwa bagian dari salmonella yang digunakan dalam reagen itu memang benar bagian dari salmonella. Hal ini dapat dicapai melalui proses standarisasi. Selanjutnya, ada pasien yang telah mendapatkan vaksin dan hasil tes widal akan positif dan mungkin saja pasien tersebut tidak sedang menderita demam thypoid, tetapi demam yang disebabkan oleh patogen yang lain. Hal ini merupakan dampak dari hasil positif palsu, sensitivitas yang sangat rendah. Maka, hasil positif ditetapkan jika titer sudah lebih besar 2-3 x lipat dari sampel yang diambil sebelumnya (2-3 minggu). 

Klinisi menganggap bahwa infeksi telah terjadi saat titer antibodi telah mencapai 1/160. Hasil tes harus dilaporkan dalam bentuk no aglutination, aglutinasi titer 1:20 dst. Hal ini lebih baik dibandingkan dengan pelaporan hasil yang hanya menuliskan positif dan negatif. 

Bagaimana melakukan Tes Widal ?

Siapkan sampel, sampel untuk tes widal adalah serum yang didapatkan dari proses pemisahan darah yang diambil oleh phelobotomist. Volume darah yang diambil adalah 5 mL menggunakan spuit atau tabung tanpa antikoagulan atau tabung SST. 

Siakan reagen tes widal yang umumnya terdiri dari kontrol positif, kontrol negatif, dan antigen yang terdiri dari antigen O, H, AH dan HB. Jumlah antigen pada masing-masing reagen dapat berbeda. Kit dari BEACON menyediakan hingga 8 jenis antigen. 

Pertama, lakukan tes Widal menggunakan slide. 

jika hasil positif (aglutinasi), maka dilanjutkan uji Kedua menggunakan tabung.

Alat yang disiapkan untuk tes Widal menggunakan slide antara lain :

1. Rotator
2. Slide
3. Batang pengaduk
4. Mikropipet
5. Tips kuning

Prosedur Kerja :

1. siapakn slide, beri identitas pada slide pada masing-masing lingkaran yaitu nama antigen, kontrol positif dan kontrol negatif. 
2. tambahkan 20 uL serum ke dalam masing-masing lingkaran antigen, dan 1 uL serum untuk kontrol.
3. tambahkan 1 tetes antigen sesuai identitas dari masing-masing lingkaran pada slide, tidak ada 1 lingkaran ditetesi dengan >1 antigen yang berbeda. 
4. teteskan juga reagen kontrol.
5. homogenkan dengan batang pengaduk dan slide dapat diletakkan pada rotator selama 1 menit.
6. interpretasikan hasil. 

Interpretasi hasil tes Widal dengan Slide :

• Aglutinasi : positif 
• Tidak ada aglutinasi : Negatif

Jika ada aglutinasi, dilanjutkan pada tes Widal menggunakan tabung. 

Alat dan bahan yang disiapkan untuk tes Widal menggunakan tabung antara lain :

1. 8 tabung reaksi
2. Antigen yang positif pada tes Widal Slide
3. NaCl 0.9%
4. Kontrol Positif 
5. Mikropipet dan tip
6. Pipet tetes
7. Rak tabung
8. Waterbath

Prosedur kerja :

1. Siapkan waterbath pada suhu 37 derajat celcius 
2. Susun semua tabung pada rak tabung secara berurutan dengan label 1 hingga 8. 
3. Tambahkan 1.9 mL NaCl 0.9% ke dalam tabung 1
4. Tambahkan 1 mL NaCl 0.9% ke dalam tabung 2 - 8
5. Tambahkan 100 uL serum ke tabung 1, homogenkan
6. Ambil 1 mL dari tabung 1, pindahkan ke tabung 2, homogenkan 
7. lakukan hal yang sama seperti pada langkah ke-6 dari tabung 2 hingga tabung 7 (pengenceran bertingkat).
8. buang 1 mL pada tabung 7.
9. Tambahkan 1 tetes kontrol positif pada tabung ke-8. 
10. Teteskan 1 tetes reagen widal yang positif pada tabung 1 hingga 8.
11. homogenkan dan inkubasi selama 24 jam dalam waterbath
12. interpretasikan hasil 

Interpretasi hasil tes Widal dengan tabung:

• Aglutinasi : positif 
• Tidak ada aglutinasi : Negatif
• Tabung 1 = titer 1:20 
• Tabung 2 = titer 1:40
• Tabung 3 = titer 1:80
• Tabung 4 = titer 1:160
• Tabung 5 = titer 1:320
• Tabung 6 = titer 1:640
• Tabung 7 = titer 1:1280

hasil ditulis ada tidaknya agltuinasi, jika ada aglutinasi disertai dengan penulisan titer pada tabung terakhir yang terlihat aglutinasi. 

Tes Widal Punya Banyak Kekurangan, apakah ada tes lain untuk menggantikan ?

• Deteksi antigen dalam darah 

• Gold standard tetap kultur 

• Sampel bis aberupa feses